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质粒图谱怎么看

归档日期:07-25       文本归类:多点标记      文章编辑:爱尚语录

  大多数质粒都会有箭头,箭头有两种解释。一种是转录方向,转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头,是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向,复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。

  还需要提到的是F1启动子(图上的f1 ori)代表的是噬菌体的复制起始方向,只能复制出单链的DNA哦,但是可以用来测序。看懂转录的方向,这样就方便设计插入片段的位置和方向性。

  报告基因:通常会有一两个蛋白,被用作报告基因,比如常见的copGFP(绿色荧光蛋白),Puro(嘌呤霉素),Lacz(乳糖操纵子)等等。和抗性基因不同,这样的报告基因,并不是为了在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用的。

  而是在质粒转入表达体系后起到作用的,基本上就是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达,有的会另外用一个独立的启动子进行表达(比如shRNA的质粒中)。

  MCS(Multiple Cloning Site,也就是多克隆位点),一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序,一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的,需要注意的是这样几点。

  第一点是要注意,酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点,也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。

  第二点需要注意的是,有的酶切位点,在序列中只有一个,但它上面也会标注一个*或者(dam),这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰[常见的是XbaI,TCTAG(6m)A中的TC无法切开],一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话,就需要用非甲基化的感受态细胞,如JM109或者JM110。

  末端如果有差异的话,可以把基因的ATG(甲硫氨酸)的5`末端替换1-2个碱基(变成GTG或者GCG这样),从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。而配合扩增和酶切的线`末端的冗余。

  为了可以应付3`末端的冗余碱基,在多克隆位点序列后,会有译码的终止TAA密码,即使插入的片段使得3`末端产生了移码突变,照样能使表达的蛋白正常终止掉(在酵母双杂的AD质粒中,由于插入的是随机cDNA,所以AD的载体上会常见这样的结构)。

  接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。

  严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用,只能在细胞周期的一定阶段进行复制,当细胞染色体停止复制时,质粒也就不再复制。

  松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响,在整个细胞生长周期中随时都可以复制,在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。

  不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象,反之为相容性。常用于流行病学的调查。

  (4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。

  第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

  第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

  第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。

  启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。

  增强子/沉默子-为真核l基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子,负调控序列。

  核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。

  转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。

  本人1997年毕业于浙江师范大学。一直任教初中科学学科。包括初中物理、化学、生物、地理、天文等内容。

  一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori,即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ 多l 克隆位点:MCS 克隆携带外源基因片段 P/E:启动子/增强子 Terms:终止信号 加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA 作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) Ori 的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记: (1)Ampr:水解β -内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。 (5)hygr:使潮霉素β 失活。 第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步:再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源DNA 片段。一般来说,外源DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。 第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。 相关概念: 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号 启动子-促进DNA 转录的DNA 顺序,这个DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA 分子上可以与RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子-为真核 l 基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子,负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD 序列。 l 转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这2部分共同构成 poly (A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down- stream 有一段GT 或T 富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。 三、载体及其分类 载体:即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 P.S.基因工程所用的vector 实际上是DNA 分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。 载体的分类 按功能分成:(1)克隆载体:都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA 片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨型载体)(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs 等)还具有转录/翻译所必需的DNA 顺序的载体。 按进入受体细胞类型分:(1)原核载体(2)线)穿梭载体(sbuttle vector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间)。 P.S. 穿梭质粒含原核和线个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。 基因工程载体的3个特点: (一)都能独立自主的复制:载体DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如 MCS,插在其中的外源DNA 片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样。 (二)都能便利的加以检测: 如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。 (三)都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来。 四、载体的选择和制备 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 1、 构建DNA 重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。 2、载体的类型: (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如小于10kb 选质粒。 (2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,i/哺乳类细胞表达载体。 (3)对原核表达载体应该注意3点: ①选择合适的启动子及相应的受体菌; ②用于表达线个困难和阅读框错位; ③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。选用质粒(最常用)做载体的4点要求: ①选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体); ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒小于10个。 ③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; ④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切 割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。 二、pET32a(+)自身载体表达的片段大小 The expected fusion protein expressed encoded by just the pET-32a(+) vector alone would be around 20.4 kDa. The Trx-tag by itself would contribute 12kDa. The rest is due to the two His-tags (0.8kDa each) and the S-tag (1.7kDa). The remaining 5.1kDa is due to the intervening(?) 54 amino acids between the tags and until the stop codon. 三、pET32系列载体的载体序列地址 四、pET 系列载体阅读方法 ori 是复制起始点,细的黑箭头是几个不同的转录区,其箭头方向不同,说明每个表达产物(如kan 抗性基因、LacI 等)都有独立的promoter,有时与T7 promoter 方向相反。粗的黑箭头是MCS,用于目的基因的插入,箭头方向表明目的基因的转录方向,它的转录方向可以与其它几个不同的转录区相同,也可以不同,如 Kan 抗性基因、LacI 的方向是一样的,可能与调控相关,不同的载体是不一样的。一个载体可只看它的启动子到终止子那一段,其它的可以考虑少些。 五、pET 表达菌株的相关信息 ( DE3 )指宿主为 λ DE3 溶原菌,其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶(为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物)的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶,而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达,这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。 AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株,能够在胞浆内形成二硫键,提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。 B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型,可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记,从而用于结晶学研究。 BL21 应用最广的宿主菌来源,具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。 BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成,它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。 BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株,能够改善质粒单体产量,有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。 HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样,这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。 NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株,具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力(与合适质粒)和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白, NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。 Origami 为 K-12 衍生的宿主菌,硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变,能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似, Origami ( DE3 )表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容,可用于 pET-32 载体,硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。 Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株,还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。 Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来,可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译,从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta ( DE3 ) pLysS 和 Rosetta ( DE3 ) pLacI 中,稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。 Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株,能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶( lacY )突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞,从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度,表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平(通常与 pET 载体相关)。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner ( DE3 ) pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。

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